核酸(我们常说的DNA/RNA)是核酸检测的基础物质,而核酸提取不管是“一步法”还是“两步法”,目的都是要提取出相当纯度的核酸。这也是整个核酸检测行业绕不过去的步骤,很多时候一份临床样本的核酸提取纯度高低,甚至直接决定了检测结果的有效性。
核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物,是生命最基本的物质之一。生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。核酸提取的原则首先保证核酸一级结构的完整性,其次要排除其它分子的污染。
提取核酸时要注意简化步骤,缩短提取时间;减少化学因素对核酸的降解;减少物理因素对核酸的降解;减少机械剪切力和高温;防止核酸的生物降解。
核酸提取大致分为3大部分:破碎、提取、纯化
常见细胞裂解法
物理方式:煮沸法、玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法、匀浆法;
化学方式:表面活性剂(SDS法)、碱裂解法;
生物方法:生物酶,如溶菌酶,蛋白酶K等;
常见样本提取方法总结
浓盐法:利用RNA和DNA在盐溶液中溶解度不同,将二者分离;
有机溶剂提取法:有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用;
高度梯度离心法:利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物;
吸附材料结合法:①硅质材料 高盐低PH值结合核酸,低盐高PH值洗脱;②阴离子交换树脂 低盐高PH值结合核酸,高盐低PH值洗脱;③磁珠 磁珠微粒包裹上不同基因可吸附不同的目的物,从而达到分离目的;
现在一般有手工提取和仪器自动提取两种方式,手工提取如:酚/氯仿抽提法、醇沉淀法、层析柱法、热裂解碱法、煮沸裂解法等。仪器提取就是我们现在市场上大面积推广的核酸提取仪,通常基于磁珠法,这也是现阶段和未来二三级医院需求面很广的仪器。
核酸提取纯化原则和要求
1、保证核酸一级结构的完整性;
2、排除其它分子的污染(如提取DNA时排除RNA的干扰);
3、核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子
4、尽可能降低蛋白质、多糖和脂类等大分子物质;
核酸提取纯化方法总结
1、酚/氯仿抽提法
通过酚/氯仿处理细胞破碎液或者组织匀浆后,在水相中主要溶解以DNA为主的核酸成分,在有机相中主要是脂类物质,蛋白质位于两相之间。
2、醇沉淀法
乙醇能够消除核酸的水化层,使带负电荷的磷酸基团暴露出来,Na之类的平衡离子能够与这些带电基团结合,在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用,形成沉淀。
3、过柱法
通过特殊硅基质吸附材料,能够特定吸附DNA,然后利用高盐低PH结合核酸,低盐高PH值洗脱,来分离纯化核酸。
4、热裂解碱法
碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性,再将pH值调至中性使其复性,复性的为质粒DNA,而染色
体DNA不会复性,缠结成网状物质,通过离心除去;
5、煮沸裂解法
加热处理DNA溶液时,线状染色体DNA容易发生变性,共价闭合的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象;变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。煮沸裂解法提取DNA,得量少,杂质多,DNA可能会出现断裂,主要适用于一些粗略的实验。
6、磁珠法
对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后,制备成超顺磁性氧化硅纳米级磁珠。该磁珠能与核酸分子特异性结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性,在Chaotropic盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)和外加磁场的作用下,从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA。
7、CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)
CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
8、其他方法
除了上述常用的方法之外,还有超声法、酶解法及浓盐法等等多种方法。
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